METODOLOGIA PARA ANÁLISE DE AMOSTRAS ZERO LACTOSE POR HPLC

Visando melhorar sua qualidade e o atendimento da legislação atual, metodologias rápidas e confiáveis para a identificação do teor de lactose nos diferentes alimentos são necessárias. O presente trabalho tem como objetivo descrever o uso da metodologia de Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, em inglês: High performance liquid chromatography, HPLC), uma técnica aplicada em diversas áreas da química e da biologia. Para tal fim, foi realizada uma revisão da literatura sobre o possível uso da técnica de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) na identificação de lactose em amostras nesses produtos alimentícios. Palavras-chave: Zero lactose. Cromatografia líquida de alta eficiência. INTRODUÇÃO A intolerância à lactose é uma patologia comum em diversas populações, nas mais variadas faixas-etárias (CUNHA et al.

Está condição constitui a inabilidade para digerir completamente o açúcar predominante do leite (lactose). Pode ser uma forma congênita de tipo primária e permanente, ou secundária, uma condição temporária causada por dano à mucosa intestinal. Está última afeta cerca de ¾ da população mundial atualmente e, segundo dados da Agência Brasil, cerca de 40% dos brasileiros possuem algum grau de intolerância à lactose (AGÊNCIA BRASIL, 2018). Os sintomas presentados por pessoas intolerantes à lactose e pessoas com alergia, as vezes se confundem. Objetivo Este trabalho tem por objetivo descrever o uso da metodologia de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) na identificação de lactose em amostras de produtos alimentícios. Justificativa Nos últimos anos, a indústria alimentícia vem lançando no mercado uma grande diversidade de produtos lácteos sem lactose, ou com teor reduzido de lactose, para atender um público com necessidades e restrições alimentarias especiais (LA NASA et al.

SAUER; BOUTIN; KIM, 2017). Assim, é muito importante monitorar o teor de lactose de produtos comerciais “Zero lactose” desenvolvidos pela indústria alimentícia, uma vez que oferecem essa vantagem para os consumidores com restrição alimentar e são significativamente mais custosos (DA SILVA; MARINHO, 2016). Além disso, a determinação da quantidade de lactose é importante, porquanto esse açúcar colabora com as propriedades funcionais do produto, constituindo um dos parâmetros de qualidade que pode ajudar na detecção de fraudes (ACQUARO et al. Existe potencial para retomar a taxa de crescimento histórico em 2018, e para que o Brasil permaneça como o quarto maior produtor mundial de leite nos próximos anos (VILELA et al. O leite é uma fonte nutritiva de grande importância, é um alimento considerado uma fonte de proteínas, gordura, carboidratos e outros constituintes essenciais e possui a lactose como o principal carboidrato presente em sua composição.

No leite cru, a lactose é responsável por 40% dos sólidos totais, 50 % no leite desnatado e de 70 a 80% no soro (CUNHA et al. Na Tabela 1 é apresentado a composição média do leite. Tabela 1 - Distribuição de percentual da composição do leite (valores médios) Componente Quantidade (%) Água 87,5 Extrato Seco Total (EST) = 12,5 % Gordura 3,5 Proteína (principal é a caseína) 3,5 Lactose (açúcar – Hidratos de Carbono) 4,7 Minerais 0,8 Fonte: Adaptado de (Silva; Silva; Ferreira, 2012) A composição do leite pode variar em relação com vários fatores, como por exemplo, a alimentação, espécie (bovina, caprina, ovina etc. acidez (15 – 20) graus Dornic; densidade a 15ºC (1. lactose mín. extrato seco desengordurado mín. extrato seco total mín. índice crioscópico mín. Lactose: A lactose (Figura 1) (4-O- β-Dgalactopiranosil-D-glucopiranose) é o principal carboidrato do leite e representa cerca de 70% dos sólidos do soro do leite.

Está formada pela junção de dois monossacarídeos, uma molécula de glicose e uma molécula de galactose, sendo responsável pelo sabor levemente doce do leite. Desde um ponto de vista físico-químico, a lactose está presente no leite, em média 5%, no estado molecular em solução verdadeira, com partículas de diâmetros inferiores a 1ηm. Cerca de 11% da lactose se encontra ligada as proteínas, o restante em dissolução (THAINARA; LEVANDOSKI; FAVORETO, 2016). Figura 1 Estrutura química simplificada da lactose Fonte: (SANTOS, 2011) A lactose é exclusivamente encontrada no leite de mamíferos. Uma de suas grandes vantagens é a seletividade em relação aos diferentes monossacarídeos e dissacarídeos que são quantificados simultaneamente em uma única análise, o que converte a HPLC em uma técnica muito empregada na análise simultânea de diferentes açúcares, como a glicose, a frutose e a sacarose (ARGENTON, 2010).

Outras vantagens encontradas nessa técnica são sua velocidade, poder de resolução, a possibilidade de manuseio de pequenas quantidades de amostra (10-9 – 10-15g) e a simplicidade, quando comparada com outras técnicas (NOLLET; TOLDRÁ, 2012). A cromatografia é uma técnica analítica onde consegue-se identificar, quantificar e separar misturas de diferentes compostos químicos. O termo cromatografia é aplicado um número grande de sistemas e técnicas analíticas diferentes. Contudo, em todas as metodologias cromatográficas possuem em comum o uso de uma fase estacionária e uma fase móvel. • Cromatografia de partição, ou líquido-líquido; • Cromatografia de adsorção, ou líquido-sólido; • Cromatografia de troca-iônica; • Cromatografia por exclusão de tamanho; • Cromatografia de afinidade; • Cromatografia chiral. Com relação a parte instrumental, os equipamentos modernos de HPLC geralmente possuem como componentes mais importantes (KOČOVÁ et al.

TASSI et al. KATZ et al. • Sistema de reservatório fase móvel e tratamento de solventes; • Sistema de bombeamento pressurizado; • Sistema de injeção de amostras; • Colunas cromatográficas; • Detectores (absorbância, fluorescência, eletroquímico, espectrômetro de massa, etc). Pelo processo, é produzida uma subsequente oxidação da β-galactose, sendo liberado ácido galacturónico (pH 8,6). Além disso, o dinucleótido nicotinamida - adenina (NAD+) é reduzido e catalisado pela β-galactose desidrogenase. Assim, o teor da lactose é calculado pela quantidade formada de NAD reduzido, realizando a medição a 340 nm. O método descrito requer sete reagentes diferentes, dois dos quais devem ser preparados semanalmente (THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. AND ITS SUBSIDIARIES, 2016). Por um lado, a diluição simultânea e a precipitação do leite com ácido perclórico a 1%, procedimento comum utilizado na literatura, deu como resultado a pior recuperação, e a precipitação de proteína e diluição com acetonitrilo puro proporcionou uma recuperação muito fraca da lactose.

Por outro lado, a maior recuperação foi observada quando a amostra de leite foi processada com uma diluição inicial de 1: 100 (v/v) de leite, seguida por uma diluição com 70% de acetonitrilo aquoso. Além disso, esse procedimento foi o mais rápido e menos dispendioso, pelo que foi escolhido (THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. AND ITS SUBSIDIARIES, 2016). Os dados mostram um alto grau de correlação, quando um ajuste quadrático é usado. O estúdio realizado por Acquaro et al. propendeu o desenvolvimento e validação de uma metodologia para determinação da lactose empregando cromatografia líquida com índice de refração, linear em uma ampla faixa dinâmica, que instituísse tanto os parâmetros quanto as condições analíticas, com o objetivo de maximizar a quantidade de lactose extraída.

Os autores consideraram o tempo de centrifugação, a intensidade de rotação e a proporção de diluição entre solvente/amostra, como variáveis independentes. Os autores determinaram a condição de extração otimizada por meio de tratamentos estatísticos, com uma taxa de recuperação média de 105%, com proporção etanol:leite de (4:1, v/v), e rotação de 10. rpm durante 37 minutos. Estudos de validação por meio de análise de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência HPLC, com detector específico (CAD), demonstraram a especificidade, linearidade, exatidão, precisão e sensibilidade do ensaio. Igualmente, o método utilizado para análise de amostras “zero lactose” pela análise de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência HPLC, com índice de refração, mostrou precisão nos seus resultados, assim como linearidade em uma ampla faixa dinâmica.

Outros estudos reportaram diferenças entre os resultados para as amostras obtidos por hidrólise ácida. Dessa maneira, para que se promova uma análise de HAP com determinada coluna, em alguns casos, é preciso levar as amostras a processos de hidrólise enzimática da sacarose presente. Diferentes estúdios encontraram, como resultado de suas pesquisas, que amostras de alguns produtos comercializados como “zero lactose” apresentaram na verdade teores de lactose relativamente baixos. AGÊNCIA BRASIL. Cerca de 40 % da população brasileira têm intolerância à lactose. Data de acesso: julho de 2018. Disponível em: <http://memoria. ebc. gov. br%2Fnoticias%3Fp_p_id%3D101_INSTANCE_FXrpx9qY7Fb>. ANVISA. Resolução da Diretoria Colegiada - RDC No 135, de 8 de Fevereiro de 2017. Ministério da Saúde-Brasil. Revista Saúde e Pesquisa, p.

CUNHA, M. E. T. DA et al. DVOŘAČKOVA, E. ŠNÕBLOVÁ, M. HRDLIČKA, P. Carbohydrate analysis: From sample preparation to HPLC on different stationary phases coupled with evaporative light-scattering detection. Journal of Separation Science, v. Analyst, v. n. p. LA NASA, J. et al. p. NOLLET, L. M. L. TOLDRÁ, F. W. BOUTIN, M. A. KIM, J. H. P. DE B. Produção Alimentícia, 2012. Data de acesso: julho de 2018. Disponível em: <http://200. A. Intolerância à Lactose: uma breve revisão para o cuidado nutricional. Arquivos de Ciência da Saúde da UNIPAR, 2002. THAINARA, A. LEVANDOSKI, D. SARCINELLI, M. F. DA SILVA, L. C. Características do leite.